三聚氰胺試劑盒
產(chǎn)品介紹
【測定原理】
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測牛奶和水產(chǎn)等樣本中的三聚氰胺，在微孔條上預包被上偶聯(lián)抗原，利用抗原與抗體的特異性**化學反應的原理來進行，樣本中的三聚氰胺和微孔條上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣品中的三聚氰胺含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出三聚氰胺含量。
【試劑盒技術(shù)指標】
規(guī) 格：96孔/盒
靈 敏 度： 1ppb
檢測時間： 75min
三聚氰胺試劑盒樣本檢測下限：
奶粉………………………………………………20 ppb
牛奶………………………………………………16 ppb
牛奶/奶 粉（處理法二）……………………… 1 ppb
組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）……………………2 ppb
飼 料 …………………………………………100 ppb
蛋 類 …………………………………………20 ppb
血 清 ………………………………………… 4 ppb
交叉反應率
三聚氰胺 …………………………………………100%
三聚氰酸……………………………………………60%
三 嗪 ……………………………………………< 1%
三嗪二銨…………………………………………< 1%
回收率
牛奶/奶 粉 ……………………………………90±15%
組 織 …………………………… 85±10%
飼 料 …………………………… 85±10%
蛋 類 …………………………… 80±10%
【試劑盒組成】
1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）
2、 標準液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb
3、 酶標記物 12ml………………… 紅色帽
4、 抗體工作液 7ml………………… 綠色帽
5、 底物A液 7 ml………………… 棕色帽
6、 底物B液 7 ml …………………黑色帽
7、 終止液 7 ml …………………黃色帽
8、 20X濃縮洗滌液40 ml……………白色帽
9、 2X濃縮復溶液 50 ml ……………藍色帽
三聚氰胺試劑盒【所用儀器、試劑】
具備的儀器：微孔板、酶標儀、勻質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：單道 20ul～200ul、100ul～1000ul
多道 250 ul
試 劑：乙腈、氫氧化鈉 、濃鹽酸、去離子水、正己烷、甲醇
【實驗前溶液配制】
配液1、將2X濃縮復溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復溶液+1份去離子水）用于樣本的復溶。
配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按 所需用量配制洗滌液。
配液3 1M HCl 溶液取8.6ml濃HCl加去離子水定容至100ml。
配液4 1M NaOH 溶液稱取4g NaOH加去離子水定容至100ml。
配液5 0.1M NaOH 溶液稱取0.4g NaOH加去離子水定容100ml。
配液6 乙腈-0.1M NaOH溶液84ml乙腈和16ml0.1MNaOH混合均勻。
【樣本前處理步驟】
樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、豬、牛、羊、兔、魚、蝦等。
（b）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
三聚氰胺試劑盒樣本處理方法
（a）牛奶專用樣本處理方法：
1、取牛奶樣本600μl到2ml的離心管中，加入1ml乙腈，充分振蕩混勻；4000r/min以上離心5min；
2、取100μl上清液，再加入500μl復溶液(見配液1)，混勻；
3、取50μl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):16倍
（b）奶粉專用樣本處理方法：
1、稱取2.0±0.05g奶粉樣本至50ml離心管中，加入4ml甲醇，充分振蕩；
2、15℃4000r/min以上離心10min，取100μl上清液，再加入900μl復溶液(見配液1)，混勻；取50μl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):20倍
（c）飼料樣品處理方法：
1、將飼料樣品研碎，稱2.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入2ml1MHCl，加入16ml去離子水均質(zhì)。
2、旋流1min，放振蕩器上振蕩2min15℃4000r/min以上離心15min，取出10ml上清液并用1MNaOH將pH值調(diào)至6-8。（注：因飼
料樣品的不同，加入1MNaOH的量有所差異，根據(jù)情況調(diào)節(jié)，一般加入范圍是0.5ml—1ml之間）。
3、15℃，4000r/min以上離心15min，吸出上清液。（如果上清仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過濾）。
4、用稀釋后的復溶液10倍稀釋上清液（取100μl上清液加入900μl稀釋后的復溶液，并且混合均勻，混合30s）。
5、取50μl進行分析
樣本稀釋倍數(shù):100倍
（d）牛奶/奶粉樣本處理方法（處理法二）：
1、取2ml奶樣或2g奶粉至離心管中；加入8ml乙腈-0.1MNaOH充分振蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min，取4ml上清液在56℃條件下氮氣或空氣流吹至完全干燥；
2、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；
3、取50μl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1倍 定量下限定為：2ppb
（e）組織（雞/豬/鴨/魚/蝦/肝臟）樣本處理方法：
1、取2.0±0.05g均勻組織樣本于50ml離心管中；加入8ml乙腈-0.1MNaOH充分振蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min，取2ml
上清液在56℃條件下氮氣或空氣流吹至完全干燥；
2、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；
3、取50μl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：2 倍
（f）蛋類樣本處理方法：
1、用均質(zhì)器低速均勻樣本（蛋清、蛋黃或全蛋）稱取2.0±0.05g均質(zhì)過的樣本，加入8ml乙腈-0.1MNaOH充分振蕩2min；（注：蛋 清含蛋白成份高，加入提取液后會形成一團膠狀物，較蛋黃或全蛋難易搖勻，此情況為正常現(xiàn)象不影響實驗結(jié)果）15℃， 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液在56℃條件下氮氣或空氣流吹至完全干燥；
2、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；
3、取下層相用稀釋好的復溶液按1：3 （50μl樣本液加150μl稀釋后的復溶液）稀釋，混合30s；
4、取50μl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：20倍
（g）血清樣本處理方法：
1、取0.5ml血清樣本于50ml離心管中；
2、加入2ml乙腈-0.1MNaOH充分振蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min，取1ml上清液在56℃條件下氮氣或空氣流吹至完全干
燥；
3、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復溶液混合30s，離心去除上層正己烷相；
4、取50μl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：4 倍
三聚氰胺試劑盒【酶標**分析程序】
1、從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
4、加標準品/樣本 50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應30min。
5、取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250μl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6、每孔加入酶標記物100μl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍（同上），用吸水
紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、顯色：每孔加入底物A液50μl，再加底物B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
8、測定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測
定每孔OD值。
【結(jié)果判定】
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與三聚氰胺的含量成負相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 1ppb為1.816；3ppb為1.415；9ppb為0.74；27ppb為0.313；81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是27ppb-81ppb; 樣本2的濃度范圍是3ppb-9ppb，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實際濃度。
2、定量判定：
所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以**個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
以標準品百分吸光率為縱坐標，以三聚氰胺標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大
量樣品的準確、快速分析。
3、標準曲線：
B/B0 (%)
1 3 9 27 81
(ppb) [μg/kg]
圖1：三聚氰胺檢測試劑盒的回歸曲線
4、再現(xiàn)性：
%CV
0 1 3 9 27 81
(ppb) [μg/kg]
圖2：三聚氰胺檢測試劑盒的精密度
由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出三聚氰胺檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應三聚氰胺濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。
【注意事項】
1、使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一
步操作。
3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
4、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、該試劑盒*佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【儲存】
原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。
【有效期】
有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。