黃曲霉**M1試劑盒
產(chǎn)品介紹
【產(chǎn)品簡介】
黃曲霉**是一類**（如黃曲霉和寄生曲霉）的有毒的代謝產(chǎn)物，它們具有很強的致癌性，主要存在于谷物、堅果、棉籽以及一些和人類血液，動物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中。其中黃曲霉**M1（AFM1）的毒性、致癌性、污染頻率均居于首位。薄層色譜一直是檢測黃曲霉**常用的方法，但是此方法制備樣品及分析樣品時費時又費力。而使用黃曲霉**M1 ELISA試劑盒則能夠快速而準(zhǔn)確的分析樣品中黃曲霉**M1殘留。
黃曲霉**M1試劑盒【測定原理】
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物黃曲霉**M1和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭黃曲霉**M1抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物黃曲霉**M1的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉**M1的含量。
【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】
規(guī) 格：96孔/盒
靈 敏 度： 0.025ppb
檢測時間： 75min
樣本檢測下限：
牛奶……………………………………………0.25ppb
奶粉、奶油、奶酪……………………………0.025ppb
飼料……………………………………………2.5ppb
反應(yīng)率：
黃曲霉**M1……………………………………100%
黃曲霉**M1試劑盒回收率：
食 品…………………………………………85±10%
飼 料…………………………………………75±10%
【試劑盒組成】
1、 微量測試孔：（1X96孔板）每條8孔，一板12條
1、 標(biāo)準(zhǔn)液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.025ppb、0.1ppb、0.5pp、1ppb、2ppb
2、 酶標(biāo)記物 12ml…………………………紅色帽
3、 抗體工作液 7ml…………………………綠色帽
4、 底物液 A液 7ml…………………………白色帽
5、 底物液 B液 7ml…………………………黑色帽
6、 終 止 液 7ml…………………………黃色帽
7、 20X濃縮洗滌液40ml…………………… 透明帽
8、 5X濃縮樣品稀釋液50 ml…………………藍色帽
【所用儀器、試劑】
儀 器：微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量
0.01g）
微量移液器：單道 20μl～200μl、100μl～1000μl、多道 250μl
試 劑：甲醇、正己烷、濾紙
黃曲霉**M1試劑盒【樣本前處理步驟】
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
樣本前處理需配制：
配液1、樣品提取液：70%甲醇溶液30ml蒸餾水或去離子水和70ml純甲醇混合制備70％甲醇溶液。
配液2、將5X濃縮樣品稀釋液用去離子水按照1：4稀釋（1 份濃縮樣品液+4份去離子水）用于樣品的稀釋。
（a）生鮮牛奶；
1、直接取50μl牛奶+450μl樣品稀釋液混合30s；
2、取50μl用于檢測檢測分析。
樣本稀釋倍數(shù):10
（b）奶粉、奶油、奶酪
1、稱取5g樣品于50ml離心管中，加入10ml甲醇，強力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。
2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。
3、用1ml正己烷溶解殘留物，加入1ml稀釋后的樣品稀釋液混合30s；室溫4000r/min以上，離心5min，
4、取50ul下層溶液進行檢測分析。
樣本稀釋倍數(shù):1
（C）飼料
1、稱取2g粉碎的樣品于50ml離心管中，加入10ml 的提取溶液混合；強力振蕩5分鐘。
2、用Whatman No.1濾紙過濾；收集過濾液。
3、取出上清液50ul與樣品稀釋液950ul 充分混合30s，取50ul進行檢測分析。
樣本稀釋倍數(shù):100
【酶標(biāo)**分析程序】
測定前應(yīng)須知：
1、 使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
黃曲霉**M1試劑盒操作步驟：
1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌
液。
4、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250μl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍頭刺
破）。
7、 每孔加入酶標(biāo)記物100μl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍（同上），用吸水
紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、 顯色：每孔加入A液50μl，再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
9、 測定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）測定吸光
度值（OD值）。
【結(jié)果判定】
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與黃曲霉**M1的含量成負相關(guān)。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.350， 樣本2的吸光度值為0.890，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.810；0.025ppb為1.550；0.1ppb為1.030；0.5ppb為0.580； 2ppb為0.211。則樣本1的濃度范圍是0.5ppb-2ppb； 樣本2的濃度范圍是0.1 ppb-0.5 ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉**M1的實際含量。
2、定量判定：
所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以**個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以黃曲霉**M1標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉**M1實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線：
B/B0 (%)
0.025 0.1 0.5 2
黃曲霉**M1(ppb) [μg/kg]
圖1：黃曲霉**M1檢測試劑盒的回歸曲線
4、再現(xiàn)性：
%CV
0 0.025 0.1 0.5 2
黃曲霉**M1 (ppb) [μg/kg]
圖2：黃曲霉**M1檢測試劑盒的精密度
由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出黃曲霉**M1檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)黃曲霉**M1濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。
【注意事項】
1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行
下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒*佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【儲存】
原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。
【有效期】
有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。