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問(wèn)題
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可能原因
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驗(yàn)證或解決辦法
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背景高
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封閉不充分/未加封閉劑
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延長(zhǎng)封閉時(shí)間
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更換合適的封閉劑（脫脂奶粉、血清、BSA等）
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一抗?jié)舛冗^(guò)高
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增加一抗稀釋倍數(shù)
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抗體孵育溫度過(guò)高
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4℃孵育
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二抗非特異性結(jié)合
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設(shè)置二抗對(duì)照（不加一抗），降低二抗?jié)舛?
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一抗或二抗與封閉劑有交叉反應(yīng)
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在孵育和洗滌液中加入Tween-20以減少交叉反應(yīng)
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洗膜不充分
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增加洗滌次數(shù)
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膜不合適
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NC膜比PVDF膜背景低
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膜干燥
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保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象
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沒(méi)有陽(yáng)性條帶或很弱
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一抗、二抗等不匹配
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訂購(gòu)試劑時(shí)認(rèn)真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物?？赏ㄟ^(guò)設(shè)置內(nèi)參來(lái)驗(yàn)證二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)的有效性
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一抗或/和二抗?jié)舛鹊?
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增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間
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封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)
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封閉時(shí)使用溫和的去污劑，如Tween-20
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更換封閉劑（脫脂奶粉、BSA、血清或明膠等）
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一抗不識(shí)別目的物種的靶蛋白
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檢查說(shuō)明書，或做ClustalW比對(duì)，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照
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樣本中無(wú)靶蛋白或靶蛋白含量過(guò)低（抗原無(wú)效）
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設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，如果陽(yáng)性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒(méi)有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標(biāo)本上樣量至少每孔20-30ug蛋白,樣本制備時(shí)使用蛋白酶抑制劑,或分級(jí)提取目的蛋白
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轉(zhuǎn)膜不充分,或洗膜過(guò)度
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使用麗春紅S檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果,PVDF膜需浸透,需正確的轉(zhuǎn)膜操作,勿過(guò)度洗膜
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過(guò)度封閉
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使用含0.5%脫脂奶粉或無(wú)脫脂奶粉的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少封閉時(shí)間
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一抗失效
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使用有效期內(nèi)抗體,分裝保存,避免反復(fù)凍融取用, 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用
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二抗受疊氮鈉抑制
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所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑制劑)
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酶和底物失效
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直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說(shuō)明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物,使用新鮮的底物
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曝光時(shí)間過(guò)短
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延長(zhǎng)曝光時(shí)間
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多非特異性條帶或條帶位置不對(duì)
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細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多，導(dǎo)致其蛋白表達(dá)模式分化
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使用原始或傳代少的細(xì)胞株，或多做平行實(shí)驗(yàn)
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體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修飾形式：乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等
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查文獻(xiàn)，使用去修飾的試劑使蛋白恢復(fù)其正確的大小
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蛋白樣本降解
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使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑
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新蛋白或同族蛋白分享同種表位的不同剪接方式
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查其它文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，或BLAST搜尋，使用說(shuō)明書報(bào)導(dǎo)的細(xì)胞株或組織
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一抗?jié)舛冗^(guò)高
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降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶
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二抗?jié)舛冗^(guò)高 產(chǎn)生非特異性結(jié)合
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降低抗體濃度，增加二抗對(duì)照
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選擇特異性更強(qiáng)，只針對(duì)重鏈的二抗
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抗體未純化
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使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶
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蛋白存在二聚體或多聚體
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SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10 min， 以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性
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背景有白色/黑色斑點(diǎn)
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轉(zhuǎn)膜時(shí)有氣泡或抗體分布不均
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盡量去除氣泡，抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng)
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抗體與封閉劑結(jié)合
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過(guò)濾封閉劑
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暗片現(xiàn)白條帶
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一抗或二抗加入過(guò)多，導(dǎo)致高濃度HRP把底物消耗過(guò)快
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稀釋抗體的濃度
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目的條帶過(guò)低/過(guò)高
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SDS-PAGE膠濃度選擇不合適
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調(diào)整膠濃度，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠
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“微笑”條帶
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遷移過(guò)快
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降低電泳速度，低溫電泳（冷室）
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電泳溫度過(guò)高
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條帶拖尾
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蛋白量太大
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摸索*適蛋白量
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一抗?jié)舛忍?
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降低一抗?jié)舛龋瑴p少孵育時(shí)間，同時(shí)洗滌時(shí)嚴(yán)格按照要求時(shí)間和次數(shù)進(jìn)行
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一抗孵育時(shí)間太長(zhǎng)
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出現(xiàn)重影
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壓片時(shí)，輕微移動(dòng)了一段距離
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X光片放上去之后，就不要?jiǎng)恿耍词狗磐崃艘矝](méi)關(guān)系
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出現(xiàn)非均一性背景
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膜干燥
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在每一步的操作過(guò)程中，都要注意不要讓膜干燥
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某個(gè)條帶變形
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凝膠中存在氣泡或不溶性顆粒
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配膠過(guò)程中要小心，使用無(wú)雜質(zhì)的液體
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條帶呈啞鈴狀
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凝膠配制不合格
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充分混勻，防止膠凝固后不均一
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拔梳子時(shí)要小心，避免膠孔變形
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*邊緣條帶彎曲
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電泳電流不均一
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換用新的電泳槽
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不使用兩邊的兩孔
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條帶出現(xiàn)縱向條紋
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樣品中含有不溶性顆粒
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去除樣品中的不溶性顆粒
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轉(zhuǎn)膜不充分
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膜沒(méi)有完全均勻濕透
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使用100% methanol浸透膜
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靶蛋白分子量小于10,000
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選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間
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靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液pH值
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可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液
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甲醇濃度過(guò)高
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過(guò)高甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替
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轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠
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對(duì)于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間
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