蔬菜中有機磷農(nóng)殘快速檢驗法——酶抑制率法(分光光度法)

實驗原理

根據(jù)有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥能抑制乙酰膽堿酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反應(yīng)底物碘化乙酰硫代膽堿和乙酰膽堿酯酶，如果蔬菜不含有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留或殘留量低，酶的活性就不被抑制，實驗中加入的底物就能被酶水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)。如果蔬菜的提取液含有農(nóng)藥并殘留量較高時，酶的活性被抑制，底物就不被水解，當(dāng)加入顯色劑時就不顯色或顏色變化很小。用分光光度計在412nm處或農(nóng)藥殘毒快速檢測儀測定吸光值，根據(jù)計算出的抑制率，就可以判斷蔬菜中含有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的情況。

實驗試劑

1. pH8.0緩沖液  分別稱取11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，溶解于1000 mL蒸餾水中。

2. 乙酰膽堿酯酶(實驗專用酶)  根據(jù)酶活力用緩沖溶液溶解，3 min的吸光值變化ΔA₀值應(yīng)控制在0.3以上。搖勻后在0~5℃冰箱中保存，保存期不超過4天。

3. 底物碘化乙酰硫代膽堿  稱取25.0 mg碘化乙酰硫代膽堿，用3.0 mL緩沖溶液溶解，在0~5℃下保存。保存期不超過2周。

4. 顯色劑  分別稱取160 mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6 mg碳酸氫鈉，用20 mL緩沖溶液溶解，4℃冰箱保存。

5. 可選用由以上試劑配置的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的ΔA₀值應(yīng)控制在0.3以上。

實驗設(shè)備

1. 分光光度計或相應(yīng)的農(nóng)殘快速檢測儀；

2. 天平(0.01g)；

3. 恒溫水浴或恒溫培養(yǎng)箱。

實驗材料

待測果蔬

實驗步驟

1. 樣品處理

選取有代表性的蔬菜樣品，去掉不可食部分后稱取蔬菜試樣，沖洗掉表面泥土，剪成1 cm左右碎片。取樣品1 g，放入燒杯或提取瓶中，加入5 mL緩沖液，振蕩1~2 min，倒出提取液，靜置3~5 min，待用。

2. 對照溶液測試

先于試管中加入2.5 mL緩沖液，再加入0.1 mL酶液、0.1 mL顯色劑。搖勻后于37 ℃放置15 min以上(每批樣品的控制時間應(yīng)一致)。加入0.1 mL低物搖勻，此時檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入比色皿中，記錄反應(yīng)3 min的吸光度的變化值ΔA₀。

3. 樣品溶液測定

先于試管中加入2.5 mL樣品提取液，其他操作與對照測定相同，記錄反應(yīng)3 min的吸光度的變化值ΔA_t。

4. 結(jié)果計算：

              抑制率(%)=

        式中   ΔA₀——對照液反應(yīng)3 min吸光度的變化值；

              ΔA_t——樣品溶液反應(yīng)3 min吸光度的變化值。

5. 實驗結(jié)果判斷：

當(dāng)蔬菜樣品提取液對酶的抑制率大于50% 時，表示樣品中有高劑量的有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留，可判定樣品為陽性結(jié)果，對檢驗結(jié)果陽性的樣品需重復(fù)檢驗兩次以上。

檢驗結(jié)果記錄：

注意事項

1. 對檢驗結(jié)果陽性的樣品，需用其他方法進一步確定殘留農(nóng)藥的種類和進行定量測定。

2. 酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限為：

3. 蔥、蒜、蘿卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性，處理樣品時，可采取整株(體)蔬菜浸提或采用表面測定法。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株(體)蔬菜浸提法，減少色素的干擾。

4. 當(dāng)溫度條件低于37℃，酶反應(yīng)速度隨之放慢，藥片加液后放置反應(yīng)的時間也應(yīng)相對延長，延長時間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對照測試的吸光度變化

ΔA₀在0.3以上為準(zhǔn)。注意樣品放置時間應(yīng)與空白對照溶液放置時間一致才有可比性。酶的活性不夠和溫度太低都可能造成膽堿酯酶空白對照液3 min的吸光度ΔA₀變化值＜0.3。

5. 該法適用于大量蔬菜樣本的篩檢，不適用于*后的仲裁檢測。